|
|
Studium účinku modifikace virových částic polyhistidinem na jejich intracelulární lokalizaci a dopravu genů do jádra
Číhařová, Barbora ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Grantz Šašková, Klára (oponent)
Virové vektory odvozené od myšího polyomaviru jsou vhodným nástrojem pro studium přístupů, které se používají v nanomedicíně pro dosažení efektivního přenosu terapeutických látek do buněk, do míst jejich cílového účinku. Vektory odvozené od myšího polyomaviru jsou stejně jako mnohé nanočástice často zachyceny v endosomu a následně degradovány. Diplomová práce se proto zabývá možností modifikace takovýchto vektorů, která by zajistila efektivnější přenos do cytosolu či až do jádra. Tato práce přinesla poznatky o zefektivnění přenosu částic modifikovaných pomocí membránově aktivních peptidů kovalentně vázaných ke kapsidovému proteinu VP3 lokalizovanému uvnitř částice. Pro kovalentní genetické modifikace VP3 proteinu byl využit polyhistidinový peptid KH27K a jeho potenciál ke zvýšení efektivity transdukce modifikovaných virových částic byl srovnáván s modifikací pomocí peptidů LAH4 nebo R8. Výsledky transdukčního testu ukázaly, že kovalentně navázaný peptid R8 je schopen proti nemodifikovaným částicím několikanásobně zvýšit účinnost dopravy do jádra. Modifikace LAH4 se naopak ukázala být účinnou pouze v případě, kdy byly částice s LAH4 asociovány pouze nekovalentně, v takovém případě byl přenos do jádra proti kontrolním částicím až 40- násobně efektivnější. Modifikace polyhistidinem, který by měl dle...
|
|
|
Experimentální systém pro produkci IL-15 na virových nosičích
Musil, Dominik ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent)
Interleukin 15 má velký potenciál pro využití například v biologické léčbě nádorových onemocnění. Je zapojen do celé řady imunitních procesů, kde mezi nejdůležitější z nich patří ovlivnění a indukce proliferace NK buněk a T-lymfocytů. Při terapeutickém použití je jeho nevýhodou nízká stabilita a krátký poločas života v organismu. Z tohoto důvodu jsou zkoumány různé možnosti, jak ho stabilizovat a rozšířit jeho biologickou aktivitu. V rámci této práce byl analyzován nový přístup, kdy byly využity virové nanostruktury odvozené od hlavního kapsidového proteinu myšího polyomaviru VP1 jako nosiče IL-15. VP1 proteiny tvořící nanonosiče mohou být relativně snadno modifikovány a jsou schopné umožnit průnik do nádorové tkáně. V bakulovirovém expresním systému v buňkách SF9 byly spolu s kontrolními nanostrukturami produkovány dvě varianty lidského IL-15, z nichž jedna byla tvořena samotným IL-15 a druhá fúzním proteinem IL-15 a zkrácenou variantou VP1. Proteinové konstrukty byly charakterizovány elektronovou mikroskopií a biochemickými metodami. Celkový proteinový výtěžek fúzní varianty VP1ΔC-IL15-HIS byl vyšší (dosahoval až 53 mg/L kompletního média) než samotného IL-15 (8,5 mg/L). Při testování biologické aktivity připravených proteinových konstruktů nicméně nebyla u žádného z nich prokázána indukce...
|
|
|
Vývoj techniky pro transfer genů do T-lymfocytů pomocí polyomavirových struktur a peptidu LAH4
Schreiberová, Lucie ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Efektivní doprava genetického materiálu do T-lymfocytů je klíčová při genové terapii využívající T-lymfocyty s chimérickými antigenními receptory. Dosavadní postupy vyžadují použití potenciálně nebezpečných virových vektorů nebo velké množství vstupního materiálu. Diplomová práce se proto soustředí na prozkoumání nových přístupů pro transfer genů do T-lymfocytů: využití bezpečných viru podobných částic (VLP) odvozených od myšího polyomaviru v kombinaci s amfipatickým kationickým peptidem LAH4. LAH4 má potenciál zvyšovat efektivitu dopravy DNA i virových vektorů do buněk. Systém kombinující VLP a peptid LAH4 byl optimalizován pro dopravu reportérových genů (kódujících GFP a luciferázu) do modelové T-lymfocytární linie Jurkat. Bylo zjištěno, že pomocí VLP se zabalenou DNA nelze efektivně transdukovat buňky Jurkat. Při transfekci buněk samotnou DNA s LAH4 nebylo dosaženo konzistentních výsledků a efektivita transfekce se pohybovala od 0,5 do 19 %. V rámci diplomové práce byl také analyzován vliv fosforylace virových struktur na transfer genů. Byl studován dopad opůsobení virových částic alkalickou fosfatázou na infektivitu viru a bylo nutné analyzovat vliv reakčních složek. Sublytická koncentrace Tritonu-X100 v reakčním pufru pozitivně ovlivňovala infektivitu MPyV více než vlastní defosforylace. V...
|
|
|
Preparation of Monoclonal Antibodies Against VP2 Protein of Human Polyomaviruses
Vochyánová, Klára ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Růžičková, Šárka (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo připravit dva proteinové antigeny a dvě monoklonální protilátky, založené na minoritním proteinu VP2 lidských polyomavirů BK viru a Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk. Proběhla příprava monoklonální protilátky proti unikátní části proteinu VP2 BK viru (N-koncový epitop, který se nenachází u proteinu VP3). Buněčná linie produkující protilátku s touto specificitou nebyla zatím nikdy ustavena kvůli nízké imunogenicitě tohoto epitopu. Náš přístup byl z hlediska imunizace myší úspěšný, ale později v průběhu přípravy nastaly vážné problémy se stabilitou hybridomové linie. Dalším cílem této práce byla příprava monoklonální protilátky cílené na sekvenci proteinu VP2 Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk. Imunizace myší a hybridomová fúze byly provedeny úspěšně. Po čtyřech kolech klonování za účelem přípravy ustaveného klonu bylo devět klonů vybráno k rozpěstování. Rozpěstování pravděpodobně vedlo ke snížení specificity protilátky a ke ztrátě produkce u většiny hybridomů. Jednou zopakované klonování by mělo vyústit v získání ustaveného klonu s dostatečnou produkcí. Příprava dvou proteinových antigenů byla provedena ve dvou expresních systémech. DNA kódující VP2 protein BK viru zkrácený na C-konci a fúzovaný s His-tagem byla klonována do vektoru vhodného pro expresi v...
|
|
|
Příprava chimerických VLP myšího polyomaviru nesoucích epitopy maligního melanomu
Kojzarová, Martina ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Tachezy, Ruth (oponent)
Hlavní kapsidový protein virů z čeledi Polyomaviridae je schopen samovolně se uspořádat do viru podobné částice (virus-like particle, VLP), a to i bez přítomnosti minoritních proteinů, nespecificky vázat cizorodou DNA a rozpoznat receptor na povrchu buňky. Tyto vlastnosti ho předurčují k použití coby vektoru v genové terapii nebo imunoterapii. Už dříve bylo zjištěno, že VLPs myšího polyomaviru výrazně stimulují imunitní systém a mají silný adjuvantní účinek. Chimerické VLPs odvozené od myšího polyomaviru nesoucí cizorodý antigen či epitop by podle našich předpokladů po imunizaci měly vyvolat přesně cílenou odpověď imunitního systému. Hlavní překážkou je volba imunogenu dostatečně silného k vyvolání adekvátní imunitní odpovědi. Cílem této práce bylo za pomoci metod genového inženýrství zkonstruovat chimerické částice nesoucí na svém povrchu epitop maligního melanomu, který je znám jako jeden z nejimunogennějších nádorů. Pro účely budoucího výzkumu imunogenních účinků těchto částic byly zkonstruovány tři typy VLPs. Jednalo se o částice nesoucí epitopy lidského melanomu, další obsahující epitop melanomu myšího a kontrolní částice s ovalbuminovým epitopem. K účelům produkce chimerických proteinů byl použit bakulovirový expresní systém. Elektronovou mikroskopií bylo ověřeno, že vnesením nádorového...
|
|
|
Využití rostlin při přípravě vakcín proti lidskému papillomaviru
Dlabalová, Lucie ; Moravec, Tomáš (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Papillomaviry způsobují různá onemocnění od kožních bradavic až po léze vedoucí ke vzniku maligních nádorů. Mezi lidmi jsou velice rozšířeny. Proto se v současnosti vyvíjí metody produkce levných a účinných vakcín jak pro jejich prevenci tak i terapii nádorů. V současnosti jsou k produkci farmaceutik nejčastěji používány živočišné a mikrobiální expresní systémy, které mají mnoho nevýhod a v budoucnu nemohou pokrýt poptávku. Otevírá se tak možnost využití rostlin jako potenciálně velmi efektivních producentů léčiv. Rostlinné expresní systémy se optimalizují a dochází ke zvyšování výtěžků, intenzivně se hledají cesty jejich nejlepšího a nejbezpečnějšího způsobu využití. Tato práce shrnuje a porovnává výhody a nevýhody různých způsobů transformací rostlin, vedoucí buď ke stabilní produkci požadovaného proteinu v transgenních rostlinách, nebo přechodné expresi prostřednictvím rekombinantního rostlinného viru infikujícího netransgenní rostliny. Dále hledá nejvhodnější rostlinné druhy, poskytující vysoké výtěžky ve spojení s určitou transformační metodou a umožňující snadný způsob pěstování, popisuje několik základních způsobů optimalizací exprese a nastiňuje budoucnost rostlinných expresních systémů.
|
host ::
RSS.